| 柳铭山,周细根,欧湘滢,高宗泽,李婷婷,冯敏,何康,胡有生.斑马鱼PKR的dsRBM1和dsRBM3重组及体外功能分析[J].井冈山大学自然版,2019,40(4):23-28,45 |
| 斑马鱼PKR的dsRBM1和dsRBM3重组及体外功能分析 |
| IN VITRO FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE RECOMBINANT DSRBM1 AND DSRBM3 FROM ZEBRA FISH（DANIO RERIO）PKR |
| 投稿时间：2019-03-16 修订日期：2019-05-18 |
| DOI：10.3969/j.issn.1674-8085.2019.04.005 |
| 中文关键词: DrPKR dsRBM13 二聚化 Poly I:C pull-down 重组 |
| 英文关键词: DrPKR dsRBM13 dimerization Poly I:C pull-down recombination |
| 基金项目:国家自然科学基金项目（31560595）；江西省教育厅科技计划项目（GJJ170630）；井冈山大学第六批大学生创新创业训练计划项目（65） |
| 作者 | 单位 | | 柳铭山 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 | | 周细根 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 | | 欧湘滢 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 | | 高宗泽 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 | | 李婷婷 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 | | 冯敏 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 | | 何康 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 | | 胡有生 | 井冈山大学医学部基础医学与药学院, 江西, 吉安 343009 |
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| 中文摘要: |
| 为了重组斑马鱼（Danio rerio）双链RNA依赖的蛋白激酶（DrPKR）的双链RNA结合模体1（dsRBM1）和双链RNA结合模体3（dsRBM3）基因，并对重组基因表达的蛋白进行鉴定和功能分析，设计定向删除引物，应用PCR技术扩增DrPKR的dsRBM1和dsRBM3的基因片段，通过重叠PCR技术将dsRBM1和dsRBM3基因重组在一起得到dsRBM13基因，再将dsRBM13构建到原核表达质粒pET32a上并表达和纯化蛋白；通过表达蛋白的二聚化实验和pull down实验对重组蛋白dsRBM13进行体外功能分析。结果： DrPKR的dsRBM1和dsRBM3重组的蛋白dsRBM13可以进行二聚化和多聚化，且能结合Poly I：C （人工合成的dsRNA）。因此，重组DrPKR蛋白模体dsRBM13仍然具有二聚化和dsRNA结合活性，提示串联了三个dsRBM的DrPKR激活过程中，串联两个dsRBM对DrPKR激活是必需的，并且在DrPKR结合dsRNA的激活过程中，因dsRNA的长短和空间结构的多样性，含有三个dsRBM的DrPKR可能存在更强和更多的结合方式，因此具有更强的抗病毒免疫反应功能。 |
| 英文摘要: |
| To recombine the gene of dsRBM1 and dsRBM3 of double-stranded RNA dependent PKR (DrPKR) in zebra fish (Danio rerio), identify and analyze the function of the expressed protein in vitro, directional deletion primers were designed to amplify the gene segment of dsRBM1 and dsRBM3 of DrPKR, which were recombined to obtain dsRBM13 by overlapping PCR, then dsRBM13 was transferred to pET32a to express and purify the recombined protein; the dimerization assay and Poly I:C pull-down assay were introduced to test the function of the protein in vitro. The results showed that dsRBM13 could dimerize and multimerize, which also bind to poly I:C (synthetical dsRNA). Thus, the recombinant dsRBM13 could dimerize and bind to poly I:C, which implied that it was essential for two dsRBM in tandem to activate DrPKR; Furthermore, because of the diversity of length and spatial structure of dsRNA, DrPKR with three dsRBM could bind to dsRNA more powerful and with more binding pattern, hence, it might have a stronger function for antiviral immunity. |
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